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旋涡混合器在染色体标本的FISH技术的应用

发布时间:2012-11-26   点击次数:1782次
  (一)实验目的
  
  1.掌握FISH技术的一般原理,及其基本实验方法;
  
  2.了解FISH技术的发展概况,以及应用范围。
  
  (二)实验原理
  
  FISH是以分子杂交为基础,应用非放射性荧光物质标记核酸探针,通过碱基互补的原理与靶DNA杂交,在核中或染色体上显示靶DNA序列位置的方法。FISH技术可分为四个步骤:样品制备、探针标记、杂交及其检测。
  
  (三)实验准备
  
  1.材料染色体标本或血涂片
  
  2.试剂甲醇、乙醇、乙酸、标记探针(生物素标记探针或地高辛标记探针)、3mol/L乙酸钠、甲酰胺(分子生物学级和粗制品)、杂交缓冲液(4×SSC,20%硫酸葡萄糖)、鲑精DNA、磷酸钠、Tween20、BSA、检测液(5μg/ml荧光素偶联的亲和素或6μg/ml罗丹明偶联的抗地高辛抗体)DAPI
  
  3.仪器低温高速离心机、荧光显微镜、MixPlus旋涡混合器、移液器、恒温水浴锅、培养箱、烤箱
  
  (四)实验方法与步骤
  
  1.探针混合与变性
  
  (1)混合20~60ng标记探针DNA和3~5μg鲑精DNA。反应后体积少于10μl,可直接冻干;若体积较大,可加1/20体积的3mol/L乙酸钠和2倍体积100%乙醇沉淀DNA。混匀并于-70℃30min。在4℃,12000r/min离心10min,弃上清,沉淀物以300μl70%乙醇洗涤后在离心(同上),弃上清,冻干。
  
  (2)将DNA重悬于5μl去离子的甲酰胺中,室温旋涡混匀3min。
  
  (3)加入5μl杂交缓冲液,,MixPlus旋涡混合器中混匀5min。
  
  (4)将DNA探针置于75℃水浴中变性5min。迅速置于冰浴中5min,备用。
  
  2.样本处理
  
  (1)染色体制备标本或血涂片在室温下依次用70%、90%、100%的乙醇脱水,各5min。凉干备用。
  
  (2)变性前将载玻片置60℃烤箱内孵育,目的是防止变性液加至载玻片时温度降低。
  
  (3)将变性液在水浴箱中加热至70℃。
  
  (4)将预热的载玻片移至含变性液(70%去离子甲酰胺、2×SSC和50mmol/L磷酸钠)的Coplin广口瓶内2min。
  
  (5)立即将载玻片依次移入70%、90%和100%预冷的乙醇中,各5min。防止DNA复性。
  
  (6)空气干燥。
  
  3.杂交
  
  (1)将10μl含变性探针的杂交混合液加至载玻片上变性的靶DNA上。
  
  (2)在杂交液上盖上盖玻片,防止产生气泡。
  
  (3)用橡胶泥将盖玻片四周封好,并置湿盒内37℃温浴过夜。
  
  4.检测
  
  (1)从湿盒内取出载玻片,除去橡胶泥。
  
  (2)将载玻片置于42℃预温的漂洗液A(50%甲酰胺,2×SSC)中,在恒温水浴摇床中振荡10min,并使盖玻片脱落。更换漂洗液A两次,每次振荡5min。
  
  (3)将载玻片移入60℃预温的漂洗液B(1×SSC~0.1×SSC,pH7.0,根据实验需要调整。),漂洗5min,更换漂洗液B两次,每次5min。
  
  (4)将载玻片取出,甩尽液体,加200μl封闭液(3%BSA,4×SSC,0.1%Tween20),盖上盖玻片,防止气泡产生,置于湿盒内,37℃温浴30min以上。
  
  (5)移去盖玻片,除去多余液体,加200μl检测液(5μg/ml荧光素偶联的亲和素或6μg/ml罗丹明偶联的抗地高辛抗体,缓冲液为1%BSA、4×SSC和0.1Tween20),在37℃湿盒内温浴30min。
  
  (6)移去盖玻片,将载玻片置于漂洗液C(4×SSC,0.1%Tween20,pH7.0)中,42℃振荡漂洗3次,各5min。
  
  (7)将载玻片置于复染液(2×SSC,200ng/mlDAPI)中,室温振荡20min。
  
  (8)载玻片在漂洗液D(2×SSC,0.05%Tween20)中室温温育1min~2min。
  
  (9)荧光显微镜下观察。
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