旋涡混合器在染色体标本的FISH技术的应用

　　（一）实验目的
　　
　　1．掌握FISH技术的一般原理，及其基本实验方法；
　　
　　2．了解FISH技术的发展概况，以及应用范围。
　　
　　（二）实验原理
　　
　　FISH是以分子杂交为基础，应用非放射性荧光物质标记核酸探针，通过碱基互补的原理与靶DNA杂交，在核中或染色体上显示靶DNA序列位置的方法。FISH技术可分为四个步骤：样品制备、探针标记、杂交及其检测。
　　
　　（三）实验准备
　　
　　1．材料染色体标本或血涂片
　　
　　2．试剂甲醇、乙醇、乙酸、标记探针（生物素标记探针或地高辛标记探针）、3mol/L乙酸钠、甲酰胺（分子生物学级和粗制品）、杂交缓冲液（4×SSC，20%硫酸葡萄糖）、鲑精DNA、磷酸钠、Tween20、BSA、检测液（5μg/ml荧光素偶联的亲和素或6μg/ml罗丹明偶联的抗地高辛抗体）DAPI
　　
　　3．仪器低温高速离心机、荧光显微镜、MixPlus旋涡混合器、移液器、恒温水浴锅、培养箱、烤箱
　　
　　（四）实验方法与步骤
　　
　　1．探针混合与变性
　　
　　（1）混合20～60ng标记探针DNA和3～5μg鲑精DNA。反应后体积少于10μl，可直接冻干；若体积较大，可加1/20体积的3mol/L乙酸钠和2倍体积100%乙醇沉淀DNA。混匀并于-70℃30min。在4℃，12000r/min离心10min，弃上清，沉淀物以300μl70%乙醇洗涤后在离心（同上），弃上清，冻干。
　　
　　（2）将DNA重悬于5μl去离子的甲酰胺中，室温旋涡混匀3min。
　　
　　（3）加入5μl杂交缓冲液，,MixPlus旋涡混合器中混匀5min。
　　
　　（4）将DNA探针置于75℃水浴中变性5min。迅速置于冰浴中5min，备用。
　　
　　2．样本处理
　　
　　（1）染色体制备标本或血涂片在室温下依次用70%、90%、100%的乙醇脱水，各5min。凉干备用。
　　
　　（2）变性前将载玻片置60℃烤箱内孵育，目的是防止变性液加至载玻片时温度降低。
　　
　　（3）将变性液在水浴箱中加热至70℃。
　　
　　（4）将预热的载玻片移至含变性液（70%去离子甲酰胺、2×SSC和50mmol/L磷酸钠）的Coplin广口瓶内2min。
　　
　　（5）立即将载玻片依次移入70%、90%和100%预冷的乙醇中，各5min。防止DNA复性。
　　
　　（6）空气干燥。
　　
　　3．杂交
　　
　　（1）将10μl含变性探针的杂交混合液加至载玻片上变性的靶DNA上。
　　
　　（2）在杂交液上盖上盖玻片，防止产生气泡。
　　
　　（3）用橡胶泥将盖玻片四周封好，并置湿盒内37℃温浴过夜。
　　
　　4．检测
　　
　　（1）从湿盒内取出载玻片，除去橡胶泥。
　　
　　（2）将载玻片置于42℃预温的漂洗液A（50%甲酰胺，2×SSC）中，在恒温水浴摇床中振荡10min，并使盖玻片脱落。更换漂洗液A两次，每次振荡5min。
　　
　　（3）将载玻片移入60℃预温的漂洗液B（1×SSC～0.1×SSC，pH7.0，根据实验需要调整。），漂洗5min，更换漂洗液B两次，每次5min。
　　
　　（4）将载玻片取出，甩尽液体，加200μl封闭液（3%BSA，4×SSC，0.1％Tween20），盖上盖玻片，防止气泡产生，置于湿盒内，37℃温浴30min以上。
　　
　　（5）移去盖玻片，除去多余液体，加200μl检测液（5μg/ml荧光素偶联的亲和素或6μg/ml罗丹明偶联的抗地高辛抗体，缓冲液为1%BSA、4×SSC和0.1Tween20），在37℃湿盒内温浴30min。
　　
　　（6）移去盖玻片，将载玻片置于漂洗液C（4×SSC，0.1％Tween20，pH7.0）中，42℃振荡漂洗3次，各5min。
　　
　　（7）将载玻片置于复染液（2×SSC，200ng/mlDAPI）中，室温振荡20min。
　　
　　（8）载玻片在漂洗液D（2×SSC，0.05%Tween20）中室温温育1min～2min。
　　
　　（9）荧光显微镜下观察。